Multiphotonenmikroskopie

Autoren: Maura Francis, Cory Boone, Jaclyn Wycoff

Die Multiphotonenmikroskopie, oder nicht lineare Mikroskopie, ist die ideale Methode für die Aufnahme hochauflösender dreidimensionaler (3D-) Bilder mit geringerem Photobleaching und verminderter Phototoxizität im Vergleich zur herkömmlichen konfokalen Mikroskopietechniken. Sie ist die bevorzugte Methode für die Analyse von dicken Proben lebenden Gewebes, da diese Technik einen verbesserten optischen Schnitt ohne Absorption außerhalb des Fokus ermöglicht.

Die Multiphotonenmikroskopie ist eine Unterform der Fluoreszenzmikroskopie, die ähnliche bildgebende Verfahren wie die herkömmliche Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um Strukturen in lebenden Zellen oder Geweben mit fluoreszierenden Markierungen, so genannten Fluorophoren, zu unterscheiden. Laserwellenlängen mit ausreichender Energie regen die Fluorophore zur Abgabe von Licht an, das ein Bild erzeugt. Bei herkömmlichen Techniken wird nur ein Photon benötigt, um ein Fluorophor anzuregen. Unscharfe Fluoreszenz ist bei der Standard-Fluoreszenzmikroskopie oft ein Problem, da die Fluoreszenz aus anderen Ebenen die Fokusebene stört. Bei der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie wird dieses Problem dadurch gelöst, dass unscharfes Licht mit einer Lochblende vor dem Detektor abgeblockt wird. Diese Technik ist jedoch wegen der mit ihr verbundenen Streuung und Absorption nicht ideal für die Abbildung dicker Proben. Die Bildqualität beginnt sich bei einer Dicke von etwa 100 µm zu verschlechtern, bei bestimmten Proben kann die Bildqualität jedoch bei bis zu 700 µm beibehalten werden.¹

Wie der Name schon sagt, werden bei der Multiphotonenmikroskopie mehrere Photonen gleichzeitig absorbiert, um Fluorophore anzuregen. Das Anregungslicht ist auf ein sehr kleines dreidimensionales Volumen beschränkt (Abbildung 1), so dass diese Technik im Vergleich zur herkömmlichen konfokalen Mikroskopie weniger Streuung aufweist. Die Menge des gestreuten Lichts ist ebenfalls umgekehrt proportional zur vierten Potenz der Wellenlänge des Lichts. Bei herkömmlichen Verfahren wird ultraviolettes (UV) oder sichtbares Licht verwendet, das wesentlich stärker streut als Infrarotlicht. Die geringere Streuung und Absorption der in der Multiphotonenmikroskopie üblicherweise verwendeten Infrarot-Wellenlängen ermöglicht ein tieferes Eindringen in die Probe.².

Abbildung 1: Das Anregungslicht, das bei der Multiphotonenmikroskopie entsteht, ist auf einen viel kleineren Bereich der Probe beschränkt als bei der Ein-Photonen-Mikroskopie.

Multiphotonenmikroskopie und konfokale Mikroskopie sind in Bezug auf die Geräteausstattung fast identisch, jedoch werden bei der Multiphotonenmikroskopie Ultrakurzpulslaser, wie z. B. Femtosekundenlaser, verwendet. Ultrakurzpulslaser haben eine hohe Spitzenleistung und eine kurze Pulsdauer, beides ist für die Anregung der Fluorophore erforderlich. Viele dieser Laser emittieren im NIR- bis IR-Bereich und haben hohe Wiederholraten, was sich bei lebenden biologischen Proben als vorteilhaft erwiesen hat.³ Die hohen Leistungsspitzen ermöglichen eine höhere Auflösung bei der Bildgebung und tragen zur Verringerung der Streuung bei. Im Gegensatz zur konfokalen Mikroskopie ist bei der Multiphotonenmikroskopie keine Lochblende erforderlich, da die unscharfe Fluoreszenz aufgrund des dreidimensional begrenzten Anregungsvolumens erheblich reduziert wird.

Und so funktioniert es

Manchmal wird ein Fenster in die zu untersuchende Probe eingesetzt, um eine maximale Gewebedurchdringung zu erreichen. Die Lichtdurchdringung ist in der Regel auf 1-2 mm durch das Gewebe selbst begrenzt. Durch die Verwendung eines Infrarot-(IR)-Lasers, z. B. eines Ti:Saphir-Lasers, wird weniger Licht gestreut und die Eindringtiefe erhöht.⁴ Photonen mit längerer Wellenlänge haben weniger Energie als Photonen mit kürzerer Wellenlänge, so dass mehrere IR-Photonen erforderlich sind, um ein Fluorophor zu einem höheren Energiezustand anzuregen (Abbildung 2). Wenn ein Fluorophor normalerweise mit einer Photonenwellenlänge von 350 nm angeregt wird, kann dasselbe Fluorophor in der Zwei-Photonen-Mikroskopie durch zwei Photonen mit einer Wellenlänge von jeweils 700 nm angeregt werden. Dasselbe Konzept gilt für die Drei-Photonen-Mikroskopie, mit dem Unterschied, dass drei Photonen mit der dreifachen Wellenlänge, die für die Ein-Photonen-Absorption erforderlich ist, zur Anregung des Fluorophors benötigt werden. Damit mehrere Photonen zu einer einzigen Anregung beitragen können, muss die Zeitspanne zwischen ihnen extrem kurz sein. Aus diesem Grund werden ultraschnelle Laser mit kurzen Pulsdauern und hohen Wiederholraten benötigt.

Weitere Vorteile der NIR-Wellenlängen sind die Möglichkeit der wiederholten Bildgebung und die geringere Streuung im Vergleich zu UV-Wellenlängen, die außerdem ein starkes Photobleaching verursachen können. Die Multiphotonenmikroskopie umgeht einige der Nachteile von Techniken, die auf UV-Anregung basieren, und ermöglicht den Nutzern ein tieferes Eindringen in die Probe.⁴ UV-Wellenlängen verursachen in biologischen Proben außerdem mehr Photodestruktionen.

Abbildung 2: Bei der Ein-Photonen-Absorption (A) wird ein einzelnes ultraviolettes (UV) Photon absorbiert, um Fluoreszenz zu erzeugen. Bei der Multiphotonenmikroskopie wird entweder die Zwei-Photonen- (B) oder die Drei-Photonen-Absorption (C) verwendet, bei der mehrere Photonen absorbiert werden, um Fluoreszenz zu erzeugen.

Die Multiphotonenanregung tritt auf, wenn die Energien mehrerer Photonen, die auf den Fluorophor einfallen, gleichzeitig der Übergangsenergie entsprechen, die erforderlich ist, um den Fluorophor aus seinem Grundzustand anzuregen. Der Fluorophor absorbiert je nach Technik (Zwei- oder Drei-Photonen-Mikroskopie) zwei oder drei Photonen auf einmal. Die Absorption hängt vom Quadrat der Anregungsintensität ab, so dass die Zwei- oder Drei-Photonen-Absorption nur im Brennpunkt des Systems auftritt, wo die Photonendichte am höchsten ist. Dadurch wird verhindert, dass unscharfe Fluoreszenz das Bild verdeckt, und eine Lochblende ist nicht mehr erforderlich, was die Multiphotonenmikroskopie von der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie unterscheidet. Um die Wahrscheinlichkeit einer gleichzeitigen Absorption zu erhöhen, werden schnelle, kontinuierliche Pulse in das System geschickt.² Wenn ein solcher Laser fokussiert wird, drängen sich die Photonen stärker zusammen, so dass die räumliche Dichte zunimmt.⁴ Dadurch erhöht sich auch die Gesamtwahrscheinlichkeit, dass die Fluorophore zum gleichen Zeitpunkt interagieren. Für die Multiphotonen-Anregung sind Laserpulse mit hohen Spitzenleistungen und Pulsdauern in der Größenordnung von Femtosekunden erforderlich.

Zustandekommen und Aussehen des Bildes

Da die gesamte Fluoreszenz aus einem kleinen Volumen am Fokuspunkt stammt, erfasst die Multiphotonenmikroskopie die Intensität des gesamten von der Probe ausgehenden Lichts.⁵ Der Anregungslaser wird über die Probe gescannt, um die Fluoreszenz auszulösen und das gesamte Sichtfeld des Bildes zu erzeugen. Da die Multiphotonen-Absorption nicht außerhalb des Fokusvolumens auftritt, können hochauflösende Bilder in verschiedenen Tiefen der Probe erhalten werden. Da die lokale Anregung kein unscharfes Licht erzeugt, das das Bild verdeckt, hat die Zwei-Photonen-Mikroskopie die gleiche Auflösung in der x- und y-Achse wie die traditionelle konfokale Mikroskopie.⁵ Zwei- und Drei-Photonen-Mikroskopietechniken haben eine bessere Auflösung in der z-Achse, da die unscharfe Fluoreszenz in drei Dimensionen minimiert wird.⁵ Dies führt dazu, dass kleinere Querschnittsflächen erfasst werden, wodurch feinere Details unterschieden werden können, wie in Abbildung 3 zu sehen ist.

In den meisten Konfigurationen von Multiphotonenmikroskopie-Systemen werden Photomultiplier-Röhren verwendet, um Signale mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen. Dieser Aufbau ermöglicht eine schnelle Datenerfassung, was bei Anwendungen, die eine nahezu sofortige Rückmeldung erfordern, von Vorteil wäre. Darüber hinaus können Bildverarbeitungskameras mit CCD-Detektoren oder CMOS-Detektoren (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) in zusätzlichen Pfaden eingesetzt werden, um ein Weitwinkel-Bild der Probe zu erhalten.²

Abbildung 3: Ein Bild eines Mäusetumors, aufgenommen mit Hilfe der Multiphotonenmikroskopie, mit freundlicher Genehmigung des Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI) an der Universität Wisconsin, Madison.

Abbildung 3: Bild eines Mäusetumors, aufgenommen mit Multiphotonenmikroskopie, mit freundlicher Genehmigung des Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI) an der Universität Wisconsin, Madison.⁶

Technische Details

In Abbildung 4 ist der typische Aufbau eines Multiphotonenmikroskops dargestellt. In einem Multiphotonensystem gibt es eine Vielzahl von Optiken. Die typischen Komponenten eines Multiphotonensystems sind:

IR-Laser-Anregungsquelle: IR-Quelle, z. B. ein Ti:Saphir- oder Ultrakurzpuls-Faserlaser, emittiert einen Laserstrahl mit Femtosekunden-Pulsdauer und einer ausreichend hohen Peak-Bestrahlungsstärke, um eine Multiphotonenabsorption in der Probe zu induzieren. Aufgrund der hohen Kosten von Ti:Saphir-Lasern war diese Technik früher in bestimmten Situationen nicht rentabel, aber neuere und kostengünstigere Faserlaserquellen machen die Multiphotonenmikroskopie jetzt leichter zugänglich.
Spiegel mit niedriger Gruppenverzögerungsdispersion (GDD): Ihre niedrige GDD trägt zur Minimierung der chromatischen Dispersion und Pulsverbreiterung bei. Diese Spiegel verfügen über dielektrische Beschichtungen, die so optimiert sind, dass sie einen hohen Reflexionsgrad für die Laserwellenlänge bieten, für die sie ausgelegt sind, und dass sie die GDD minimieren. Dichroitische Spiegel mit niedriger GDD werden verwendet, um Emissionssignale bei verschiedenen Fluoreszenzwellenlängen zu trennen, während mit Scannerspiegeln mit niedriger GDD die emittierte Fluoreszenz an einen Detektor weitergeleitet wird.
Bandpass-, Kurzpass-, Langpass- und dichroitische Filter: Verschiedene Arten von Filtern, in der Regel Bandpass- oder Kurzpassfilter, kommen zum Einsatz, um die Wellenlängen des Anregungslasers zu bereinigen und dann bestimmte Wellenlängen für die Detektion auszuwählen.⁷ Die Filter lassen die nichtlinearen Signale passieren. Dichroitische Filter werden häufig verwendet, um Anregungs- und Emissionswellenlängen zu trennen.
Objektiv: Häufig handelt es sich um ein unendlich korrigiertes Objektiv mit Wasser- oder Ölimmersion, das die Anregungsquelle auf die Probe fokussiert und im Brennpunkt eine Multiphotonenabsorption hervorruft. Die Fluoreszenz wird dann durch das Objektiv kollimiert und an den Detektor weitergeleitet. Objektive für die Multiphotonenmikroskopie haben in der Regel eine hohe numerische Apertur (NA), eine hohe Vergrößerung, eine chromatische Korrektur über einen breiten Wellenbereich und einen großen Arbeitsabstand.
Tubuslinse: wird hinter dem Objektiv angebracht, um die kollimierte Fluoreszenz zu fokussieren und ein Primärbild zu erhalten.
Detektor: Eine Photomultiplier-Röhre (PMT), ein Bildverarbeitungsobjektiv und eine Kamera oder eine andere Detektoranordnung sammelt die von der Fokusebene emittierte Fluoreszenz und liefert hochauflösende Bilder. 3D-Bilder können durch Scannen in verschiedenen Schärfeebenen und Zusammenfügen der Bilder erzeugt werden.

Abbildung 4: Typisches Schema eines Multiphotonenmikroskopiesystems

Anwendungen der Multiphotonenmikroskopie

Anwendung 1: Bildgebung des Gehirns

Dank der Multiphotonenmikroskopie können Forschern Bilder von Tiefen des Hirngewebes erzeugen, die bislang nicht erreichbar waren. Durch den Einsatz einer Drei-Photonen-Technik können die Forscher Bilder bis in den Hippocampus hinein aufnehmen, die Aufschluss darüber geben, wie Neuronen im Gehirn entstehen.⁸ Die Wissenschaftler sind in der Lage, Bilder in vivo anzufertigen, was für die Diagnose verschiedener Erkrankungen von großem Nutzen sein kann. In einer an Mäusen durchgeführten Studie wurden mit Hilfe der Multiphotonen-Bildgebung die funktionellen Auswirkungen von Neuronen und Astrozyten auf das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit untersucht. Die In-vivo-Bildgebung dieser Strukturen kann den Wissenschaftlern ein besseres Verständnis der Pathogenese der Krankheit vermitteln. Durch die Möglichkeit, das Gehirn mit Hilfe der Multiphotonenmikroskopie zu betrachten, können Wissenschaftler und Forscher den Verlauf der Krankheit erforschen und bessere Behandlungs- und Diagnosemethoden entwickeln.⁹

Anwendung 2: Bildgebung der Netzhaut

Die Multiphotonenmikroskopie hat sich auch bei der Abbildung der Netzhaut des Auges bewährt. Herkömmliche Methoden der Netzhautbildgebung verhindern die Beobachtung subzellulärer Strukturen aufgrund der optischen Aberrationen, die das Auge aufweist.⁷ Die Netzhautbildgebung kann bestimmte Augenerkrankungen diagnostizieren und aufgrund der Rolle der Netzhaut im zentralen Nervensystem auch degenerative Erkrankungen des Gehirns erkennen. Dies kann Hinweise auf das Auftreten von Krankheiten wie Alzheimer oder Multiple Sklerose liefern. Der Einsatz der Multiphotonenmikroskopie ist für die Bildgebung des Auges besonders vorteilhaft, da die NIR-Laser nicht mit der sichtbaren Stimulation interferieren und das Auge für längere Wellenlängen optisch transparent ist.⁷ Die hohe räumliche Dichte der Multiphotonenmikroskopie bietet hervorragende Möglichkeiten, die Strukturen im Auge zu bewerten und Erkenntnisse über Krankheitsmechanismen zu gewinnen.

Vergleich mit anderen Mikroskopietechniken⁶

Technik	Auflösung	Stichprobengröße	Relative Kosten	Photobleacing
Konfokalmikroskopie	<µm	µm	$$	Ja
Multiphotonenmikroskopie	<µm	mm	$$$	Weniger
Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie	µm	>cm	$	Am wenigsten

Multiphotonenmikroskopie bei Edmund Optics®

Edmund Optics® liefert eine breite Palette von Optiken für Multiphotonenmikroskopie-Anwendungen, darunter Spiegel mit geringer Gruppenverzögerungsdispersion (GDD), Filter, Objektive, Polarisationsfilter und Gitter. Es werden kontinuierlich weitere Komponenten, die für diese Systeme ideal sind, ergänzt, da der Anwendungsbereich der Multiphotonenmikroskopie weiter wächst.

Spiegel mit geringer GDD

Entwickelt mit hoher Reflexion für Ultrakurzpuls-Strahllenkung
Ionenstrahl-gesputterte (IBS) Beschichtungsoptionen für geringe Streuung und Absorption
Optionen mit hoher Laserzerstörschwelle verfügbar
GDD von 0 ± 20 fs^² im angegebenen Wellenlängenbereich

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Ultrakurzpuls-Laserspiegel mit Enhanced-Silber-Beschichtung

Reflexion >99% bei 600 – 1000nm oder 800 – 1150nm
Geringe Gruppenverzögerungsdispersion bis zu 0 ± 20 fs²
Ideal geeignet für Ti:Saphir- und Yb:dotierte Laser
Standardmäßige englische Größen verfügbar

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Ultrakurzpulsspiegel zur Pulskompression von UltraFast Innovations

Stark negative Gruppenverzögerungsdispersion
Ideal für die Kompression von Ultrakurzpulsen
Eine Vielzahl von Beschichtungen für gängige Wellenlängen
Branchenführende Laseroptiken von UltraFast Innovations

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Dichroitische Ultrakurzpuls-Kurzpassfilter mit geringer GDD

Dichroitische Ultrakurzpuls-Kurzpassfilter geringer GDD

Geringe Dicke sorgt für reduzierte GDD
Breite Transmissions- und Reflexionsbereiche
Ideal für Ultrakurzpuls-Laseranwendungen
Kontrolle der GDD-Spezifikation über hauseigene Messtechnik

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Dünnfilm-Polarisatoren für Ultrakurzpulslaser

Ideal geeignet für Ti:Saphir- und Yb:dotierte Ultrakurzpulslaser
Optimiert für die Trennung von S- und P-Polarisation bei 45° Einfallswinkel
Hohes Auslöschungsverhältnis von 1000:1 bei der Designwellenlänge

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Wasserimmersionsobjektive von Olympus

Wasserimmersionsobjektive mit Vergrößerungsbereichen von 10 bis 40X
Zeigt flache Bilder von hohen Transmissionsfaktoren bis in den Nahinfrarotbereich des Spektrums
Ideal für die Fluoreszenzbildgebung von Gewebe und Proben, wie z. B. Hirngewebe

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Olympus X-Line erweiterte apochromatische Objektive

Hohe numerische Aperturen (NA) bis 1,45
Korrektur der chromatischen Aberration von 400 - 1000 nm
Gleichmäßige Bildebenheit über große Bildfelder

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Mitutoyo unendlich korrigierte Objektive mit großem Arbeitsabstand

Große Arbeitsabstände
Hellfeldinspektion
Hochqualitatives planapochromatisches Design
Keine Bildfeldwölbung über das gesamte Bildfeld

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Spiegelobjektive

Großer Arbeitsabstand für einfache Systemintegration
Aktive Ausrichtung für optimale Leistung
Ultrabreites Spektralband von 190 nm bis 11 μm ohne chromatische Aberration
Beugungsbegrenzte Optionen mit transmittierter Wellenfront von λ/14 RMS

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Viele Gitter können auf kundenspezifische Größen zugeschnitten werden

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Literatur

Allen, John R. “Light Sheet Fluorescence Microscopy.” Nikon, https://www.microscopyu.com/techniques/light-sheet/light-sheet-fluorescence-microscopy
Piston, David W., et al. “Multiphoton Microscopy.” Nikon, https://www.microscopyu.com/techniques/multi-photon/multiphoton-microscopy.
“Two-Photon Microscopy.” Laser Quantum, https://www.laserquantum.com/applications/detail.cfm?id=24#:~:text=The%20laser%20used%20for%20two,interested%20in%20imaging%20living%20cells.
Larson, Adam M. “Multiphoton Microscopy.” Nature, 22 Dec. 2010, https://www.nature.com/articles/nphoton.an.2010.2.
Davidson, Michael W., and David W. Piston. “Introduction to Multiphoton Fluorescence Microscopy.” Olympus Scientific Solutions Americas Corp., https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/fluorescence/multiphoton/multiphotonintro/
Wendt, Kristy. “Multiphoton Microscopy and Second Harmonic Generation.” Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin, Madison, https://loci.wisc.edu/research/two-photon.
Qin, Zhongya, et al. “Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo.” Light: Sciences Applications, https://www.nature.com/articles/s41377-020-0317-9
May, Mike. “Shedding light on deep tissue: Multiphoton microscopy.” Science Magazine, https://www.sciencemag.org/features/2019/03/shedding-light-deep-tissue-multiphoton-microscopy.
Kelly, Patricia et al. “In Vivo two photon imaging of astrocytic structures and function in Alzheimer’s disease.” Aging Neurosci, https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnagi.2018.00219/full
Santi, P. A. (2011). Light Sheet Fluorescence Microscopy. J Histochem Cytochem, 59(2), 129-138. doi: 10,1369/0.022.155.410.394.857.