Konfokale Mikroskopie

Autoren: Maura Francis, Cory Boone, Jaclyn Wycoff

Die konfokale Mikroskopie ist eine Form der Fluoreszenzmikroskopie, bei der mit einem Laser Fluoreszenz von Fluorophoren angeregt wird, die zur Markierung verschiedener Teilbereiche einer Probe dienen. Fluoreszenzmikroskope werden für die Abbildung von fluoreszenzmarkierten Zellen und Geweben verwendet.¹ Was die konfokale Mikroskopie von der herkömmlichen Epifluoreszenz-Mikroskopie unterscheidet, ist die höhere Auflösung bei der Abbildung dicker Proben, die Beseitigung von Blendeffekten durch räumliche Filterung und die Verringerung der lichtbedingten Schädigung der Probe, der so genannten Phototoxizität.

Anstelle einer inkohärenten Wolfram- oder Quecksilberlampenquelle wie bei herkömmlichen Mikroskopen wird bei konfokalen Mikroskopen ein Laser zur Beleuchtung der Probe verwendet.¹ Das System sammelt dann Bilder auf Ebenen in verschiedenen Tiefen der Probe, so genannte optische Schnitte, indem es den Laser durch verschiedene Fokuspositionen scannt.¹ Mit optischen Schnitten können lebende Proben abgebildet werden, da die Probe nicht physisch zerschnitten werden muss. Die Beleuchtung kleinerer Abschnitte trägt auch dazu bei, dass die Proben länger lebensfähig bleiben, da die Auswirkungen der Phototoxizität deutlich reduziert werden. Die Lichtmenge, die bei konventionellen Techniken zur Beleuchtung verwendet wird, macht es schwierig, die Vitalität des abgebildeten Objekts zu gewährleisten, was bei der Erfassung biologischer Vorgänge jedoch von entscheidender Bedeutung ist.¹

Zustandekommen und Aussehen des Bildes

Im Vergleich zu Bildern, die mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden, weisen die Bilder eines konfokalen Mikroskopsystems eine geringfügig höhere axiale und laterale Auflösung auf, jedoch blockiert die räumliche Filterung durch die Lochblendenanordnung des Systems unscharfe Fluoreszenz, so dass ein wesentlich detaillierteres Bild entsteht (Abbildung 1).² Der Kontrast des Bildes wird im Vergleich zu herkömmlichen Methoden durch eine Verringerung des Hintergrundrauschens und ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis verbessert. Bei der Verwendung herkömmlicher Techniken stört die Fluoreszenz, die von benachbarten Teilen der Probe ausgeht, die Bildebene und verdeckt den Fokus.¹ Dies ist insofern problematisch, als es keine Möglichkeit gibt, die Fluoreszenz zu unterscheiden, die nicht zur abgebildeten Fokusebene beiträgt, was besonders bei Proben auffällt, die dicker als zwei Mikrometer sind.¹ Durch den Einsatz räumlicher Filtertechniken sind konfokale Mikroskope in der Lage, dieses Problem zu beheben, indem sie unscharfes Licht, das sonst das Bild verdecken würde, blockieren.² Konfokale und Multiphotonenmikroskopie haben eine ähnliche Auflösung in der x- und y-Achse, aber die Multiphotonenmikroskopie hat eine höhere Auflösung in der z-Achse oder in der Tiefe. Im Vergleich zur Multiphotonenmikroskopie wird bei der konfokalen Mikroskopie nur ein einziges Photon zur Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen verwendet, was zu einer stärkeren Lichtstreuung im Bild führen und bewirken kann, dass man nicht so tief in eine Probe hineinsehen kann. Konfokale Techniken verwenden in der Regel Licht aus dem sichtbaren Spektrum, das in biologischem Gewebe tendenziell stärker gestreut und absorbiert wird als Licht mit längeren Wellenlängen, was wiederum die mögliche Eindringtiefe in eine Probe begrenzen kann. Dennoch hat sich die Auflösung der konfokalen Technik im Vergleich zu den herkömmlichen Weitfeldmethoden als besser erwiesen, so dass die konfokale Mikroskopie als Brücke zwischen den klassischen Weitfeldmethoden und den fortschrittlicheren Superauflösungstechniken betrachtet werden kann. Die konfokale Mikroskopie eignet sich sehr gut für die Abbildung von 2D-Zellkulturen, während Multiphotonen- und Lichtscheibenmikroskopie Vorteile bei der Abbildung von 3D-Proben bieten.

Abbildung 1: Ein mit konfokaler Mikroskopie aufgenommenes Bild von Protoplasten (links), das feiner fokussiert ist als ein Bild von Mikrokugeln ähnlicher Größe, das mit herkömmlicher Epifluoreszenz-Mikroskopie aufgenommen wurde.

Technische Details

Abbildung 2 zeigt den typischen Aufbau eines konfokalen Mikroskops, das aus vier Hauptkomponenten besteht:

Laseranregungsquelle: sendet einen Laserstrahl in das System, der auf die Probe fokussiert wird.
Dichroitische Fluoreszenzfilter: reflektieren das Anregungslicht auf die Probe und leiten die von der Probe abgegebene Sekundärfluoreszenz an das Detektionssystem weiter.
Lochblende: Wesentlicher Bestandteil konfokaler Systeme, der als räumlicher Filter fungiert. Lochblenden verhindern, dass Licht, das nicht konfokal zur Brennebene des Objektivs ausgerichtet ist, das Bild beeinträchtigen.²
Schrittmotoren: Ermöglichen die schrittweise Bewegung des Laserstrahls über die Probe, wobei x- und y-Scans entlang der z-Achse erfasst werden. Dadurch wird die Erfassung dreidimensionaler Daten automatisiert und die Erstellung eines 3D-Bildes erleichtert.²
Objektiv: In der Regel wird ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) verwendet, um hohe Auflösungen zu erzielen. Häufig kommen Wasser- oder Ölimmersionssysteme zum Einsatz, um Brechungsindexunterschiede zwischen den wässrigen Medien, in denen viele lebende Proben aufbewahrt werden, auszugleichen. Lange Arbeitsabstände sind für dicke Proben und 3D-Bildgebung/optische Schnitte erforderlich.

Abbildung 2: Schematische Darstellung eines typischen konfokalen Mikroskopiesystems

Vergleich mit anderen Mikroskopietechniken³

Technik	Auflösung	Stichprobengröße	Relative Kosten	Photobleacing
Konfokalmikroskopie	<µm	µm	$$	Ja
Multiphotonenmikroskopie	<µm	mm	$$$	Weniger
Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie	µm	>cm	$	Am wenigsten

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Literatur

Paddock, Stephen W., et al. “Introductory Confocal Concepts.” Nikon, https://www.microscopyu.com/techniques/confocal/introductory-confocal-concepts.
Fellers, Thomas J., and Michael W. Davidson. “Introduction to Confocal Microscopy.” Olympus Scientific Solutions Americas Corp., https://www.olympus-lifescience.com/ru/microscope-resource/primer/techniques/confocal/confocalintro/.
Santi, P. A. (2011). Light Sheet Fluorescence Microscopy. J Histochem Cytochem, 59(2), 129-138. doi: 10,1369/0.022.155.410.394.857.